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En 1985 su implementación revolucionó los conceptos moleculares de la biología y medicina. Es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles), probablemente la técnica diagnóstica más utlizada desde la confirmación del primer caso de SARS-CoV-2 en Wuhan, China.

El método fue mundialmente conocido gracias al científico estadounidense Kary Mullis (1944 – 2019), cuyo trabajo lo condujo a la obtención del Premio Nobel de Química en 1993. “Posiblemente la persona más extraña que jamás lo haya ganado”, según publicó en 1998 The Washington Post.

“La PCR se basa en las características termoestables de una polimerasa, enzima capaz de replicar ácidos nucleicos. Al efectuar una prueba de diagnóstico, lo que se detecta es un fragmento de material genético de un patógeno o microorganismo. En el caso de este coronavirus, una molécula de ARN”, explica Inmaculada Casas, viróloga del Instituto de Salud Carlos III y miembro del Comité Científico Técnico COVID-19 de España.

Durante los últimos años, su utilización se ha masificado en laboratorios de microbiología, hospitales, centros de investigación y universidades, destacando por su alta especificidad (capacidad de diferenciar dos microorganismos cercanos evolutivamente) y sensibilidad (identifica cantidades de 20 copias/ml -o incluso menos- de material genético). Además, permite pesquisar y cuantificar la presencia de material genético de un virus en el organismo en las primeras fases de patologías respiratorias.

En el marco de la pandemia, la Organización Mundial de la Salud (OMS) considera la prueba molecular el método indicado para la confirmación de casos, priorizando su utilización frente a otras estrategias. Es más fiable, pero la tardanza en la obtención del resultado, que puede extenderse por varias horas, es su principal desventaja en comparación a los 15 a 20 minutos como máximo que ofrecen los test rápidos.

Sin embargo, la OMS aconseja el uso de estos solo para determinadas situaciones y estudios, y con fines de investigación. Para el organismo internacional, las técnicas de detección rápida de antígenos o anticuerpos no son adecuadas para el diagnóstico de infección en la fase aguda de la enfermedad. Tampoco la serología u otros métodos de inmunoensayo de alto rendimiento.

Amplificación molecular

A 35 años de su irrupción y uno del fallecimiento de Mullis, el impacto de la PCR es enorme. Su empleo no se limita a la detección de patógenos. Dentro de sus múltiples aplicaciones se puede nombrar la secuenciación del genoma humano y de otros organismos celulares y virus, el diagnóstico de trastornos genéticos, análisis prenatal, terapias personalizadas contra el cáncer, biotecnología agrícola, tipificado de tejidos para trasplante de órganos, genotipado de cultivos vegetales, análisis paleontológicos y antropológicos, análisis forenses y pruebas de paternidad y criminalística. La PCR es básica para un biólogo molecular en cualquier campo.

¿Cómo funciona? Cuando trabajaba en la síntesis de oligonucleótidos en una compañía biotecnológica en California (Estados Unidos), el científico tuvo la idea de unir por complementariedad de bases, dos oligonucleótidos que flanquean un segmento de una de las hebras del ADN.  “Actuaron como cebadores para una ADN polimerasa resistente al calor, la que logra amplificarse forma exponencial el fragmento contenido entre ambos oligos” [1].

Sin embargo, fue Kjell Kleppe quien describió primero este proceso. En 1977, el bioquímico y biólogo molecular noruego sugirió que el uso de dos cebadores (pequeño fragmento de ADN que sirve como punto de partida para la polimerasa) permitiría replicar y amplificar un fragmento de ADN [2]. Antes, Har Gobind Khorana, biólogo molecular indo estadounidense y ganador del Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1968, había dado las primeras señales con su trabajo en la interpretación del código genético y su función en la síntesis proteica. En 1972 anunció la construcción del primer gen artificial y cuatro años más tarde logró que este fuese funcional en una célula viva, hallazgo que demostró la posibilidad de sintetizar fragmentos cortos de ADN.

El mérito del controvertido investigador norteamericano, negacionista del cambio climático y del VIH como agente causal del SIDA, fue implementar mejoras y masificar el proceso. “A partir de una serie de reacciones químicas se puede replicar ADN partiendo de una muestra demasiado pequeña como para poder llevar a cabo algún experimento con ella. Imagina, por ejemplo, que quieres tejer una bufanda, pero solamente dispones de una hebra de 30 centímetros. Con la PCR esa hebra podría ser replicada para generar todos los ovillos de lana que necesitas”, simplifica Elena Blanco-Suárez, bioquímica, biología molecular y especialista en neuroplasticidad del Instituto Salk de Estudios Biológicos, en Estados Unidos.

Mullis concibió un ciclo en el que primero las dos hebras de ADN se desnaturalizaban en un baño a 95°C, luego se les agregaban los cebadores en otro baño con una temperatura entre 45-55°C y finalmente se producía la elongación o replicación de las cadenas de ADN a la temperatura óptima de la ADN polimerasa en un baño a 72°C. Este ciclo se debía repetir unas 30-35 veces para obtener la amplificación.

Pero había un problema. La ADN polimerasa utilizada provenía de Escherichia coli, la que se degradaba durante la etapa de desnaturalización debido a las altas temperaturas, por lo que se debía añadir más enzima en cada ciclo, perdiendo eficiencia.

La solución fue el empleo de una polimerasa termoestable proveniente de la bacteria Thermus aquaticus, encontrada en 1966 en los efluentes termales del Parque Nacional de Yellowstone (Estados Unidos) y capaz de sobrevivir a temperaturas de hasta 80°C.  Hasta ese momento, la comunidad científica creía que las bacterias eran incapaces de sobrevivir sobre los 55°C, sin embargo, el microbiólogo Thomas Brock y el genetista Hudson Freeze consiguieron separar bacterias de esas muestras, refutando lo establecido. Más tarde, el químico biólogo Randall Saiki aisló la enzima a partir de estos microorganismos, denominándola Taq polimerasa. Sin una enzima resistente al calor como esta, la PCR no podría utilizarse a gran escala.

Variantes técnicas

El avance de la ciencia ha sido clave en su desarrollo. El proceso se lleva a cabo de manera automática gracias a termocicladores, equipos que realizan los ciclos completos, invirtiendo la corriente eléctrica para aumentar y disminuir la temperatura. La velocidad de amplificación es mayor, lo mismo que el número de muestras por placa, favoreciendo la capacidad de almacenamiento de datos.

En los últimos años, los costos de los equipos, ahora más rápidos, sencillos y compactos, han disminuido, al igual que los reactivos. En paralelo, han aparecido variantes para cubrir otras necesidades, como las PCR anidada, múltiple y tiempo real (Q-PCR), la más sofisticada al ocupar fluorescencia para monitorizar la amplificación a medida que se produce la reacción, lo que permite cuantificar la cantidad original de ADN molde.

La reacción en cadena de la polimerasa es considerada uno de los hitos científicos del siglo XX, aunque su impacto no disminuyó con el cambio de milenio. El protagónico rol en la lucha contra el SARS-CoV-2 es solo una muestra de las múltiples aplicaciones de una técnica que sigue revolucionando a la biología molecular.

Referencias

[1] R.K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K. B. Mullis and H.A. Erlich. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 1988 Jan 29. 239(4839):487-491.
[2] Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases J. Molec. Biol. 1971.56:341–61.

Por Óscar Ferrari Gutiérrez