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30 Mayo 2016

Foco en la albúmina para curar la hemofilia

Enfoques terapéuticos basados en constructos moleculares para la producción de proteínas han reimpulsado el interés por la terapia génica. Recientemente, con el uso de vectores virales adeno asociados, se ha logrado expresar constitutivamente el factor de coagulación IX humano, transfiriendo su secuencia codificante vía vector viral, dentro del locus de la albúmina, región que presenta una alta actividad transcripcional. Esta perspectiva es particularmente útil para una patología como la hemofilia,  dado que la carencia de un único producto génico es el causante de las complicaciones de coagulación. Al utilizar ratones deficientes del factor de coagulación y logrando una exitosa entrega génica mediante este sistema, se observó una expresión estable de la proteína humana lo que condujo a una corrección del fenotipo característico de la hemofilia B. Este hallazgo abre las puertas para más investigaciones que a futuro sirvan como una terapia definitiva contra esta patología.


Terapia génica 

La hemofilia comprende un grupo de trastornos genéticos hereditarios que alteran la capacidad corporal de mantener una coagulación sanguínea normal. Las dos formas principales, la hemofilia A (deficiencia de factor de coagulación VIII) y la hemofilia B (deficiencia de factor IXL), se producen en más de 400.000 personas en todo el mundo. El tratamiento actual implica la transfusión con concentrado de plasma o con proteínas recombinantes, sin embargo, este enfoque no es curativo. Además, posee un elevado costo (más de $ 100.000 dólares por persona al año para la profilaxis), es invasivo (puede requerirse de acceso intravenoso), y por lo general no está disponible para la gran mayoría de pacientes con hemofilia. Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias para combatir esta patología.

Una alternativa terapéutica consiste en la transferencia del gen que codifica la proteína ausente o defectuosa del paciente, facilitando la síntesis endógena de la forma funcional del factor de coagulación. La transferencia de genes es particularmente atractiva para el tratamiento de la hemofilia porque el fenotipo de la enfermedad es totalmente atribuible a la falta de un único producto génico. Por lo tanto, la enfermedad puede ser superada mediante una única intervención que promueva una expresión proteica duradera. Incluso un modesto aumento en el nivel del factor puede mejorar el severo fenotipo hemorrágico. De las variadas formas de lograr la transferencia génica, el uso de virus adeno-asociado recombinantes (AAV) es particularmente útil debido a su excelente perfil de seguridad y capacidad de dirigir la expresión a largo plazo del gen de interés en células que no se dividen. Recientemente, se ha reportado el perfil de seguridad y eficacia de la transferencia de la región codificante F9 (para la síntesis del factor IX) mediada por AAV. La entrega génica fue dirigida al hígado de 10 pacientes con hemofilia B grave, y representa uno de los varios estudios que han impulsado el resurgimiento y entusiasmo por la terapia génica.

El hígado es un sitio particularmente atractivo para la transferencia de genes, ya que es el sitio de síntesis de muchas proteínas, incluyendo factores de coagulación. Es fácilmente alcanzado por los vectores AAV, de los cuales la mayoría tienen un tropismo natural hacia el órgano. En adición, algunos datos sugieren que la expresión hepática de antígenos potencialmente inmunogénicos, en el contexto de la transferencia de genes, puede mitigar la respuesta inmunitaria a la proteína transgénica. Sin embargo, debido a que el vector AAV es predominantemente un virus cuyo material genético no se integra al de la célula, existe una potencial pérdida  del genoma del vector  mantenido episomalmente durante la división celular, lo que resultaría en un descenso de la expresión del transgen en el tiempo. Su integración exitosa en el genoma del hepatocito obviaría esta preocupación. Sin embargo, la integración del ADN exógeno trae consigo su propio conjunto de complicaciones posibles - por ejemplo, oncogénesis por inserción, así como la alteración de expresión de genes endógenos, incluyendo la de proto-oncogenes, debido a efectos fuera de objetivo de la transferencia, la cual podría afectar a elementos reguladores.

Figura 1. Introducción de exones codificantes para el factor de coagulación IX dentro del gen de la albúmina.

Dos estudios recientes han demostrado un nuevo enfoque para el tratamiento de la hemofilia B en un modelo de ratón, que implica la administración sistémica de vectores virales adeno-asociados (AVV) recombinantes para transducir hepatocitos. Se emplea un constructo molecular carente de promotor capaz de codificar el factor de coagulación IX (así como nucleasas con dedos de zinc [ZFN], cuando aplica). Barzel y colaboradores mostraron la integración de F9 en el extremo del locus altamente activo de la albúmina (Alb), a través de un mecanismo denominado recombinación homóloga (panel A); Rajiv Sharma y colegas lograron el mismo objetivo, pero con una estrategia diferente: el uso de ZFN para iniciar quiebres en el ADN de doble hebra dentro del intrón 1 del locus de la albúmina, lo cual fue seguido de una unión de extremos no homólogos (NHEJ, del inglés non-homologous end joining), (panel B). En ambos estudios, la expresión del gen transducido (F9) fue dirigida por el promotor endógeno de la albúmina. El constructo utilizado por Barzel y su grupo incluye una secuencia peptídica (2A) que permite la producción de varias proteínas a partir de un único marco de lectura a través del salto del ribosoma. Por lo tanto, el gen de albúmina y las secuencias de F9 se fusionan, pero se producen finalmente 2 proteínas separadas y funcionales. El constructo utilizado por Sharma y colegas resulta en la transcripción de un ARN mensajero (ARNm) híbrido que codifica el factor IX humano y el exón 1 de albúmina de ratón (que codifica un péptido señal), así como también el ARNm de longitud completa de la albúmina, lo que resulta en la traducción de un nuevo propéptido. Este es finalmente procesado en un polipéptido funcional maduro del factor IX humano (además de la albúmina). ApoE denota la apolipoproteína E, hAAT antitripsina alfa-1 humana, ITR repetición terminal invertida, pA secuencia de poliadenilación y SA aceptor de empalme.

En dos estudios recientes, dirigidos por A. Barzel (Nature. 2015 Jan 15;517(7534):360-4) y por R. Sharma (Blood. 2015 Oct 8;126(15):1777-84) se hizo uso de las ventajosas propiedades de los AAV, integrando de manera específica el gen de interés basándose en los mecanismos de reparación genómica propios de la célula. Además aprovecharon los elementos reguladores endógenos para mediar la transcripción del transgén (figura 1). Ambos estudios utilizaron una administración vía sistémica de vectores AAV para proporcionar F9, secuencia que codifica para el factor IX humano, con el objetivo de tener este templado inserto en el locus de la albúmina del genoma de hepatocitos de ratón. Este sitio fue seleccionado por su alta actividad transcripcional (la albúmina comprende > 25% de las proteínas sintetizadas por el hígado) y porque se considera un "puerto seguro" para la integración.

Los autores de cada estudio encontraron una expresión estable del factor IX, lo que implica que el templado de integración se había producido, y como resultado se obtuvo una corrección fenotípica de la hemofilia B en ratones deficientes del factor de coagulación. Esta corrección se produjo a pesar de que el análisis molecular reveló una tasa muy baja de integración (aproximadamente 0,5%), lo que apoya la utilidad de dirigir la transferencia génica hacia un gen de gran actividad transcripcional. No se observó ningún signo de transaminitis ni perturbaciones en los niveles de albúmina sérica, además se evidenció una baja integración en sitios fuera de objetivo. Adicionalmente, Sharma y sus colegas demostraron la versatilidad de su plataforma al conseguir síntesis y secreción de una variedad de proteínas para varias enfermedades.

El éxito clínico de estos enfoques dependerá de demostraciones adicionales en cuanto a su seguridad, incluyendo la minimización de inserciones fuera de objetivo y la inmunogenicidad, así como la confirmación de que el locus de la albúmina es un lugar apropiado para la integración. Además, se necesita una eficacia suficiente lograda en modelos animales a gran escala, dado el pobre rendimiento de transducción de los vectores AAV en primates no humanos, en comparación con ratones. Por último, los polimorfismos del gen de la albúmina pueden impedir una aplicación universal de este enfoque. Sin embargo, estos hallazgos son interesantes y sugieren una mejora del equipamiento técnico para efectuar una expresión segura y a largo plazo, para una variedad de proteínas secretadas desde el hígado con el objetivo de lograr una cura permanente para una plétora de enfermedades genéticas y de otra índole.

Fuente bibliográfica

Genetic Targeting of the Albumin Locus to Treat Hemophilia

Andrew M. Davidoff, M.D., and Amit C. Nathwani, M.D., Ph.D.

Department of Hematology, University College London Cancer Institute, London (A.C.N.).

DOI: 10.1056/NEJMcibr1600347

Ciencia y Medicina

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